Kinetyka oddziaływania melityny z modelowymi dwuwarstwami lipidowymi

Abstract

Przedmiotem badań jest poznanie kinetyki adsorpcji melityny na powierzchni liposomów i jej ewentualnej integracji do ich wnętrza. Pomiary prowadzone były na znakowanych fluorescencyjnie liposomach w funkcji składu lipidowego liposomów oraz w funkcji stosunku ilości peptydu do lipidu. Proces adsorpcji melityny monitorowany był poprzez rejestrację kinetyk zmian intensywności fluorescencji znakowanych liposomów po dodaniu peptydu. W pracy wykorzystano fluorescencyjną technikę pomiaru w zatrzymanym przepływie (ang. stopped-flow), która umożliwia obserwację kinetyk procesów zachodzących w szerokim przedziale czasowym. Wynikiem takiego pomiaru jest krzywa zmian intensywności fluorescencji w czasie. Otrzymane wyniki wskazują na różnice w oddziaływaniu melityny z dwuwarstwą lipidową w zależności od jej składu lipidowego oraz stosunku ilości peptydu do lipidu.
Autor: Mirosława CELMER-MOŚ

1. WIADOMOŚCI PODSTAWOWE

1.1. MELITYNA

Melityna jest głównym peptydem wchodzącym w skład jadu pszczelego. Zbudowana z 26 aminokwasów posiada charakter amfifilowy, tj. dwadzieścia N-końcowych aminokwasów melityny wykazuje charakter hydrofobowy, natomiast sześć C-końcowych aminokwasów - hydrofilowy. W fizjologicznym pH, 6 z 26 aminokwasów peptydu posiada ładunek dodatni [1]. Cechy strukturalne peptydu, takie jak amfiflowość cząsteczki i jej dodatni ładunek determinują destabilizujący charakter oddziaływania melityny z błonami biologicznymi, sprawiając, iż jest ona jednym z najsilniej działających peptydów cytolitycznych poznanych do dzisiaj.

1.2. LIPOSOMY

Liposomy są to sferyczne pęcherzyki zbudowane z dwuwarstwy lipidowej stanowiące uproszczony, lecz dobrze zdefiniowany model błony biologicznej (Rys.1.).



Właściwości fizykochemiczne dwuwarstwy, takie jak powierzchniowy ładunek elektrostatyczny, nasycenie łańcuchów lipidowych czy upakowanie lipidów modyfikowano poprzez odpowiedni dobór lipidów wchodzących w skład formowanych liposomów. W celu obserwacji kinetyk adsorpcji melityny na powierzchni modelowych błon biologicznych i jej integracji do ich wnętrza, powierzchnie (zewnętrzną jak i wewnętrzną) liposomów, o zadanym składzie lipidowym, znakowano sondą fluorescencyjną (fluoresceina) kowalencyjnie związaną z cząsteczką lipidu. Wydajność kwantowa fluoresceiny rośnie wraz ze wzrostem lokalnego pH (spadkiem stężenia protonów) wokół sondy (Rys .2), stąd lokalne obniżenie stężenia protonów na skutek adsorpcji dodatnio naładowanej melityny na powierzchni dwuwarstwy, skutkuje wzrostem intensywności rejestrowanego sygnału fluorescencyjnego.



1.3. TECHNIKA POMIAROWA

Do pomiaru kinetyk adsorpcji melityny na powierzchni modelowych błon biologicznych i jej ewentualnej integracji do ich wnętrza wykorzystano fluorescencyjną technikę pomiaru w zatrzymanym przepływie (ang. fluorescence stopped-flow). Technika stopped-flow umożliwia obserwację kinetyk procesów zachodzących w szerokim przedziale czasowym (10-3 - 103 sekund). Pomiar polega na jednoczesnym zmieszaniu określonych objętości fluorescencyjnie znakowanych liposomów i melityny. Oba roztwory trafiają do komory pomiarowej, gdzie zostają oświetlone światłem laserowym o zadanej długości fali, odpowiadającej maksimum wzbudzenia sondy fluorescencyjnej zastosowanej do znakowania. Proces wstrzykiwania jest w pełni zautomatyzowany tak, aby nowo powstały roztwór jak najszybciej trafił do komory pomiarowej (Rys. 3).



W wyniku asocjacji melityny z powierzchnią liposomów następuje spadek lokalnego stężenia protonów wokół sondy, obserwowany jako wzrost intensywności fluorescencji fluoresceiny.